基因編輯陽性細(xì)胞篩選：技術(shù)策略與優(yōu)化流程

陽性細(xì)胞篩選是基因編輯的核心環(huán)節(jié)，其效率直接影響實(shí)驗(yàn)周期與成功率。

一、篩選目標(biāo)與挑戰(zhàn)

1. 核心目標(biāo)

• 從混合細(xì)胞群中分離成功編輯的細(xì)胞（如基因敲除/KO、敲入/KI）。

• 排除野生型細(xì)胞干擾（未編輯細(xì)胞占比高時(shí)，易導(dǎo)致假陰性）。

2. 關(guān)鍵挑戰(zhàn)

• 細(xì)胞損傷：長期篩選導(dǎo)致細(xì)胞老化（豬成纖維細(xì)胞傳代后增殖能力驟降）。

• 假陽性風(fēng)險(xiǎn)：部分編輯未wan全破壞基因功能（如移碼突變未致功能喪失）。

• 通量瓶頸：傳統(tǒng)單克隆培養(yǎng)需22天以上，且陽性率不足20%。

二、主流篩選技術(shù)及操作流程

（一）基于報(bào)告系統(tǒng)的富集技術(shù)

利用修復(fù)機(jī)制觸發(fā)熒光/抗性標(biāo)記表達(dá)，實(shí)現(xiàn)可視化和快速分選：

操作流程（以NHEJ-GFP系統(tǒng)為例）：

1. 構(gòu)建含GFP-TAA終止子的編輯載體（sgRNA靶向TAA區(qū)域）。

2. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，NHEJ修復(fù)破壞終止子→GFP表達(dá)。

3. 72h后使用流式細(xì)胞儀（如iQue®）分選GFP?細(xì)胞。

（二）微量細(xì)胞快速鑒定法

突破性方案：僅需50個(gè)細(xì)胞即可完成基因型鑒定，縮短周期15天以上。

關(guān)鍵參數(shù)：

• 細(xì)胞量：≥50個(gè)（20細(xì)胞組檢出率不足，P<0.01）。

• 酶切靈敏度：T7E1可檢測(cè)≥5%的編輯效率。

• 驗(yàn)證步驟：Sanger測(cè)序確認(rèn)突變類型（如插入/缺失）。

（三）酶切與測(cè)序驗(yàn)證技術(shù)

操作優(yōu)化：

• 混合克隆預(yù)篩：FA-PCR檢測(cè)群體編輯率，＞30%時(shí)再分選單克隆。
  

   

• 雙驗(yàn)證策略：T7E1初篩陽性克隆 → Sanger測(cè)序確認(rèn)（避免假陽性）。

三、技術(shù)選擇與場景適配

（一）按細(xì)胞類型選擇

（二）按編輯類型選擇